下面是小编为大家整理的层析柱装柱流程,供大家参考。
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
操 作 标 准
目的：为了使 BPG300层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此
操作规范。
范围：配合 ?KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。
责任人：层析工序操作人员
标准操作程序：
1 基本术语概念
填料因子（ Packing Factor, PF）：指在在装柱过程中，用低流速（如 60cm/h）
对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度（柱高）的比
值，
GEHC 生产的各种常见填料的 PF 参见《 GEHC AxiChrom 300-1000 columns User
Manual 28-9562-89 Edition AA 》；
线性流速（ linear flow rate）：单位时间内液体流经的直线距离，常用 cm/h 表
示；
体积流速（ volume flow rate）：
单位时间内液体流经的空间容积，常用 ml/min
表示；
1
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换算：
2 准备工作
2.1 检查层析柱的完整性，所带配件，是否水平（用水平仪矫正） ，是否清洁
（如有污染应进行清洗） 。
2.2 确定所用填料及其特性、浓度等
以 DEAE SepharoseFast Flow 填料为例，其填料因子（ PF）为 1.15，新填料
（slurry）浓度为 75%（保存于 20%乙醇中），耐压 3bar。
2.3 确定放大后的工艺参数
以 XX 生化制药股份有限公司的放大工艺为例，
中试工艺参数：
柱高 h=10cm；
体积流速 v1=3ml/min；
柱内径 d=1.6cm.
即，线性流速 v2=v1/s 柱=3/(3.14 ×0.82) cm/min=1.5 cm/min；
样品与填料接触时间 t=h/v2=10/1.5min=6.67min；
在工艺的线性放大中 h、v2 和 t 均不变，则可保证样品出峰的位置（洗脱时间）和形
状不变。
使用 BPG300层析柱进行放大的工艺参数：
装柱体积 V 柱= S柱 h=3.14×1.52×1L=7L；
装柱需要 slurry 体积 Vslurry=V 柱×PF/Cslurry
以 DEAE Sepharose Fast Flow为填料，
则，Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L；
装入柱中的 slurry 高度 Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14 1×.52)dm=1.52dm=15.2cm.
3管路安装
3.1 层析柱管道和配件安装
3.1.1 卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈，旋松密封调节器，用纯水或 20%乙醇
充分浸润柱内壁和柱头 O 型圈；
3.1.2用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝，并通过旋转高度调节手柄将柱
头旋至最高处，在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀，在柱底安装四路二
2
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通阀；
3.1.3 在顶部四路二通阀上横向连接一根细管，另一端连至 ?KTA process上端
连接口 COLUMN TOP，同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至 ?KTA
process的下端连接口 COLUMN BOTTOM 。
图 1、BPG300 层析柱安装示意图
3.2层析柱下端筛网排气泡
3.2.1连接两根足够长的细管到 ?KTA process进样泵的 A1 和 B1 进口，两管另
一端均放入纯水中；
3.2.2 从 A1 泵入纯水：打开 UNICORN 软件，在 system control 窗口点击
manual→valves→InletA ，选择 inletA1 ，insert；
InletB，选择 closed，insert；
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Column，选择 upflow，insert；
Pump→Flow，设定流速 60L/h，点击 execute运
行程序充水至 BPG 柱中 2-3cm 左右，pause，清除下端筛网中的空气，用注射
器吸出筛网中残留的气泡。
4装填料
4.1准备填料
所用填料为 DEAE Sepharose Fast Flow ，装置的是保存于 20%乙醇中的新
slurry；
4.2 卸下柱头，用搅拌棍引流加入混匀的 slurry 至 15.2cm 处，再加入纯水至
40cm 左右，充分搅拌混匀，同时避免挤压筛网和柱壁，静置使填料界面至少
低于 38cm；
4.3 在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA，选择 inletA1，insert；
InletB，选择 closed，insert；
Column，选择 downflow，insert；
Pump→Flow，
设定流速 60L/h，点击 execute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡，再
装上柱头，用密封调节器固定柱头，拧紧螺丝；
4.4 在 system control 窗口点击 manual→Pump→Flow ，设定流速为 42L/h
（60cm/h），进行填料的沉降，待填料高度降至 14cm左右，将密封调节器旋至
全松，将柱头快速调至距离填料 3-4cm 处，将密封调节器旋至半松，将柱头快
速调至滤网距离填料 1-2cm，旋紧密封调节器，再设定高流速（如 150L/h），
继续压缩填料，最后再调节柱头至 10cm。整个过程一直有流速，泵速不能停。
5 柱效测定
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图 2、 柱效测定示意图
5.1 平衡
将 A1 接口细管放入 0.4M NaCl 溶液中，将柱顶端四路二通阀调至管路与大
气相连状态，在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA，选择 inletA1，
insert；
InletB，选择 closed，insert；
Column，选择 downflow，insert；
Pump→
Flow，再设定高流速（如 150L/h），点击 execute运行，排气泡，再将阀调至管
路与柱头相连状态，平衡 3-5 个柱体积至电导曲线稳定，点击 END；
5.2上样
5.2.1将 B1 接口细管放入 2M NaCl 溶液，柱顶端四路二通阀调至管路与大气相
连状态，在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA，选择 Closed，
insert；
InletB，选择 InletB1，insert；
Column，选择 downflow ，insert；
Pump
→Flow，设定高流速（ 150L/h）点击 execute运行，排气泡， pause；
5.2.2 在 system control窗口点击 manual→Other→End_Timer，选择 Acc. V olumn,
Timeout 设上样量为 70mL（1%柱体积）；
Pump→Flow，设定上样流速 60L/h，
点击 execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连，完成上样；
5.3 洗脱
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5.3.1 将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态，在 system control 窗口点
击 manual→valves→InletA ，选择 inletA1，insert；
InletB，选择 closed，insert；
Column，选择 downflow ，insert；
Pump→Flow，设定高流速（ 150L/h）点击
execute 运行，排气泡，同时将管路充满 0.4M NaCl 溶液，调流速至 21L/h
（30cm/h）；
5.3.2 待流速稳定后，在 system control 窗口点击 manual→valves→Injection
Mark，insert，点击 execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连，
开始洗脱，在一个柱体积左右，电导检测下将产生目的峰。
5.4 测柱效
在 Evaluation 窗口中，选择实验保存的结果，在结果图中点击鼠标右键，选
择 Properties，点击 Clear，并选中 Cond_102，点击 OK。回到 Evaluation 窗口，
选择积分按钮，在弹出窗口中，选择 Cond_102，peak window 中调整积分的范
围，并在 Reject Peaks中，填 Peak must be one of 1 largest；
确定后，在积分结
果窗口，点击右键，选择 Properties，在 peak table 选项中，勾选 Plate Height
（HETP）和 Asymmetry。确定后即可计算得到计算理论塔板高度 HETP 和对
称因子 As。
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1 When calculating the amount of media to be packed use the Compression Factor
1.1 instead of the Packing Factor above which is used during packing.
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